Устройство светового микроскопа и техника микроскопирования. Микроскопы, их устройство, техника микроскопирования микроорганизмов, правила обращения с микроскопом

Цель занятия: Познакомиться с принципами работы и использования приборов специальной микроскопии в исследовательских целях. Закрепить навык микроскопирования гистологического препарата.

¨ Задание:

1. Заполните таблицу 2, отметив основные виды микроскопии, их разновидности, кратко сформулируйте цели использования каждой разновидности.

Таблица 2

Методы и техника микроскопирования

1. Световая микроскопия. Применяются обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с различными длинами волн. В световом микроскопе можно видеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры – органеллы и включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

а) Ультрафиолетовая микроскопия. Используются более короткие ультрафиолетовые лучи с длинной волны около 0,2 мкм. Полученное невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

б) Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Суть метода заключается в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротковолновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. Применяются ртутные и ксеоновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области ближних ультрафиолетовых и сине-фиолетовых лучей. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоросценцией (часто довольно слабой).

Различают:

Первичная флюоресценция – обладают серотонин, катехоламины (адреналин и норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями – флюорохромами .

в) Фазово-контрастная микроскопия. Этот методслужит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Для этого неокрашенные структуры помещают в кольцевую диафрагму, помещаемую в конденсоре, и фазовой пластинки, находящейся в объективе. Такая конструкция оптики дает возможность преобразовать не воспринимаемы глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменение его амплитуды, т.е. яркости получаемого изображения.

г) Микроскопия в темном поле. Достигает объективатолько свет, который дает дифракцию структур в препарате. В микроскопе есть специальный конденсор, который освещает препарат строго косым светом. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. Этот метод используется для изучения живых объектов, например зерен серебра, которые выглядят светлыми на темном поле. В клинике его применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет и т.д.

д) Интерференционная микроскопия. Используется дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского), который используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В этом микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяет по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка соединяются и интерферируют между собой. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Преимущество такой микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью покадровой микрокиносъемки.

е) Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не имеет возможности попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, и в результате объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

2. Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра – первый (поляризатор) между пучком света и объективом, а второй (анализатор) между линзой объектива и глазом. Оба фильтра могут вращаться, изменяя направления пучка света. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры (в Лейдига – гландулоциты яичка) при изменении оси вращения проявляются как светящиеся. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечно-полосатых мышц.

3. Электронная микроскопия. Рассматривая характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 0,1 нм. По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. В электронном микроскопе используется поток электронов, с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. Разрешаемое расстояние в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. В современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В настоящее время используются трансмиссионные и сканирующие электронные микроскопы, которые имеют большую глубину резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от 10-ков до 10-ков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

2. Рассмотрите строение светового микроскопа. Повторите правила работы с ним.

Работа с микроскопом . Устройство типичного биологического микроскопа (рис.1). Штативная подставка выполняется в виде тяжелой отливки. К ней на шарнире прикреплен тубусодержатель, несущий все остальные части микроскопа.

С помощью тубуса, в который вмонтированы линзовые системы, можно перемещать их относительно образца для фокусировки. На нижнем конце тубуса расположен объектив.

Как правило, микроскоп снабжен несколькими объективами разного увеличения на револьверной головке, которая позволяет устанавливать их в рабочее положение на оптической оси. При исследовании образца оператор обычно начинает с объектива, который имеет наименьшее увеличение и наиболее широкое поле зрения, находит интересующие его детали, после чего рассматривает их, пользуясь объективом с большим увеличением.

Окуляр вмонтирован в конец выдвижного держателя, при помощи которого можно при необходимости изменять длину тубуса. Передвигая вверх и вниз весь тубус с объективом и окуляром, микроскоп наводится на резкость.

В качестве образца обычно берется очень тонкий прозрачный слой или срез, который кладут на стеклянную пластинку прямоугольной формы, называемую предметным стеклом, а сверху накрывают более тонкой стеклянной пластинкой меньших размеров, которая называется покровным стеклом. Чтобы увеличить контраст, образец часто окрашивают химическими веществами.

Предметное стекло кладут на предметный столик таким образом, чтобы образец находился над центральным отверстием столика. Столик, как правило, бывает снабжен механизмом для плавного и точного перемещения образца в поле зрения.

Третья система линз – конденсор – концентрирует свет на образце. Держатель конденсоров, которых может быть несколько, находится под предметным столиком. Здесь же расположена ирисовая диафрагма для регулировки апертуры. Еще ниже находится осветительное зеркало, устанавливаемое в универсальном шарнире. За счет того, что зеркало отбрасывает свет лампы на образец оптическая система микроскопа и создает видимое изображение.

Рис. 1. Микроскоп для биологических исследований.

А-общий вид: 1 - основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – коробка механизма микроподачи; 5 – револьверное устройство; 6 – предметный столик; 7 - макрометрический винт; 8 – микрометрический винт; 9 – винт конденсора; 10 – окуляр; 11 – объективы; 12 – конденсор с ирисовой диафрагмой; 13 – зеркало; Б – объективы малого (а), большого (б) и иммерсионного (в) увеличения.

3. Рассмотрите микропрепараты (Таблица 3), зарисуйте, подпишите. Укажите тип красителя и увеличение.

Таблица 3

Препараты тканей с разным окрашиванием

Микроскопическая техника - это комплекс приемов и правил обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными частями.

При работе с микроскопом прежде всего необходимо оберегать его от загрязнений (в промежутках между работой его накрывают стеклянным или картонным колпаком). Не рекомендуется часто вывинчивать объективы: срабатывается резьба и нарушается их центровка. Оптическую часть тщательно протирают много раз стиранной незагрязненной батистовой или полотняной тряпочкой, следы грязи удаляют тампоном, смоченным 95% спиртом, а затем протирают сухим тампоном. Масло снимают с поверхности линзы сухой мягкой тряпкой, а его остатки можно удалять ксилолом. С механической части прибора удаляют . Сложная чистка и смазка производится специалистом.

Работа с современными микроскопами требует применения рационального освещения, тщательного выбора оптической системы «объектив - окуляр - конденсор», а также предметных и покровных стекол необходимого качества, соответствующей подготовки препарата - объекта исследования. В качестве точечных источников света служат осветители ОИ-7, ОИ-9, ОИ-18, ОИ-19, снабженные коллекторной линзой. Осветитель устанавливают на расстоянии 30-40 см перед микроскопом. Не следует слишком ярко освещать , так как это снижает качество изображения. Установив освещение, регулируют угловую апертуру конденсора, открыв полностью апертурную диафрагму и закрыв полностью диафрагму поля (коллектора), наблюдают в микроскоп светящийся кружок (отверстие диафрагмы). Затем постепенно суживают апертурную диафрагму до момента, когда в поле зрения будет видно пятно без голубой или зеленой каймы. Качество изображения зависит от рационального применения объективов и окуляров. Пользуясь различными сочетаниями объективов и окуляров, можно получить различные увеличения. Однако выбор нужного увеличения должен определяться прежде всего объектом, целями исследования и разрешающей способностью микроскопа.

При бактериоскопии, как правило, применяются иммерсионные объективы (масляный, водный, глицериновый). Для получения хорошего изображения без применения покровного стекла рекомендуется употреблять специальное иммерсионное масло, каплю которого наносят на мазок, расположенный на предметном стекле. При работе с иммерсионным объективом нужно очень осторожно опускать тубус, чтобы не повредить фронтальную линзу объектива. Качество изображения зависит и от толщины предметного стекла (не больше 1,1-1,4 мм) и покровного стеклышка (не толще 0,15-0,17 мм).

Вспомогательными приборами при микроскопии служат: нагревательный столик, окуляр-микрометр, объект-микрометр, рисовальный аппарат и микроманипулятор.

Нагревательный столик устанавливается вместо предметного стола. Степень нагрева регулируется терморегулятором. Препарат на таком столике устанавливается, как и на обычном предметном столике микроскопа.

Окуляр-микрометр дает возможность измерения наблюдаемых объектов. С этой целью фокусируют объектив на шкале объект-микрометра, каждое деление которого равно 10 мк.

Важным разделом микроскопической техники является зарисовка объекта исследования. Рисунок можно сделать визуально или более точно при помощи рисовального аппарата. При визуальном методе в микроскоп смотрят левым глазом, а правым следят за движением карандаша на бумаге. Рисовальный аппарат насаживается на тубус микроскопа. Зеркало отбрасывает через призму изображение бумаги и карандаша, рисующего в плоскости глазной точки окуляра, в глаз, поэтому наблюдатель одновременно видит объект, бумагу и кончик карандаша.

Микроманипулятор позволяет осуществлять тонкие и точные движения микроинструментов и выполнять в поле микроскопа некоторые операции на клетке (удаление и ядер, инъекции различных веществ, отрезание различных участков и т. д.). Он состоит из системы штативов, снабженных винтами, зажимающими микроинструменты, что обеспечивает движение микроинструментов во всех направлениях.

Живые объекты () помещают на предметное стекло в каплю наиболее подходящей для них среды (можно изотонический раствор хлорида натрия) и, накрыв покровным стеклом (), рассматривают в проходящем свете в светлом или темном поле. Фиксированные и окрашенные препараты бактерий изготовляют в виде мазков или отпечатков (см. Окраска микроорганизмов).

Микроскопирование препаратов - см. Микроскопия. См. также Микроскоп.

Микроскопическая техника - правила обращения и работы с микроскопом и его вспомогательными приборами.

Важное условие успеха микроскопирования - установка освещения. Только при оптимальном освещении по Келеру (рис. 1) можно реализовать все возможности микроскопа. Чтобы установить освещение по Келеру, необходимо иметь стандартный осветитель типа ОИ-7 (рис. 2) или ОИ-19 с микролампой (с небольшой, плотно скрученной спиралью), которую можно передвигать вдоль оси осветителя. При этом свет микролампы фокусируется линзой-коллектором, и на некотором расстоянии от осветителя возникает резкое изображение спирали лампы. Площадь линзы ограничивается ирис-диафрагмой переменной величины. Резкое изображение спирали лампы направляют через зеркало микроскопа на закрытую до отказа диафрагму конденсора, представляющего светосильную короткофокусную систему линз, которая собирает весь входящий в нее световой поток на очень малый участок объекта. Весь осветитель перемещают по столу до тех пор, пока изображение спирали лампы не покроет всю диафрагму конденсора. Этот момент замечают, глядя спереди на плоское зеркало микроскопа, в котором отражается диафрагма конденсора. Если нужно, лампу в осветителе передвигают вдоль оси, пока изображение спирали не достигнет нужной величины, после чего полностью открывают диафрагму конденсора.

Рис. 1. Схематическое изображение хода лучей при освещении препарата по методу Келера: 1 - нить лампы; 2 - коллектор; 3 - диафрагма поля; 4 - изображение нити лампы в плоскости апертурной диафрагмы; 5 - апертурная диафрагма; в - конденсор; 7 - изображение краев диафрагмы поля в плоскости препарата.

Рис. 2. Микроскоп МВИ-1 с осветителем ОИ-7.

Затем на предметный столик микроскопа ставят препарат и фокусируют на нем тот объектив, с которым собираются работать.

Глядя в окуляр, движением плоского зеркала добиваются наилучшего в этих условиях освещения. Затем закрывают до упора диафрагму осветителя. Если при этом ее изображение уходит из поля зрения, его нужно вернуть движением зеркала. Поднимая или опуская конденсор, стараются сделать изображение диафрагмы осветителя резким. Этим определяется оптимальная высота конденсора при его взаимодействии с данным объективом (при работе с объективами малых увеличений приходится отвинчивать верхнюю линзу конденсора, чтобы согласовать его работу с возможностями объектива). При смене объектива изображение закрытой диафрагмы осветителя следует снова сфокусировать в фокальной плоскости объектива.

Движением зеркала изображение диафрагмы осветителя переводят в центр поля зрения. Если края изображения окрашены неодинаково (один полюс синеватый, другой - красноватый), это значит, что ось осветителя наклонена к вертикальной плоскости микроскопа. Наблюдая через окуляр, перемещают осветитель вручную так, чтобы окраска краев изображения стала одинаковой по всей его окружности. Освещенность поля зрения становится равномерной по всей площади. Остается раскрыть диафрагму осветителя настолько, чтобы ее изображение точно вписалось в поле зрения данного объектива. Световой поток будет при этом использоваться полностью и не возникнет избыточных световых пучков, которые могут породить помехи в изображении. Теперь при помощи реостата, изменяющего питание осветителя, устанавливают такой накал лампы, при котором глаз не утомляется излишней яркостью и без труда различает мельчайшие детали.

Установка освещения по Келеру - обязательное условие квалифицированной работы с микроскопом. Нарушение правильного освещения неизбежно ведет к потере разрешения и контраста, к оптическим ошибкам, особенно при микрофотографии и микрокиносъемке.

К современным микроскопам придаются различные приспособления для автоматической и полуавтоматической установки освещения. Их использование облегчает установку освещения, но не отменяет метода Келера. На базе стандартного освещения по Келеру, проделав некоторые дополнительные операции, налаживают работу всех остальных видов микроскопов. Так, например, для перехода к темнопольной микроскопии нужно после установки стандартного освещения заменить обычный конденсор темнопольным (не меняя положения остальных узлов микроскопа) и, наблюдая в окуляр, медленно поднимать его до тех пор, пока не возникнет темнопольное изображение - сверкающие частицы объекта на почти черном фоне. Предметное стекло для темнопольной микроскопии должно иметь толщину 1 -1,2 мм, иначе конденсором нельзя сфокусировать свет на объекте.

Переход к фазово-контрастной микроскопии несколько сложнее. Конденсор фазово-контрастного устройства имеет в фокальной плоскости барабан с набором кольцевых диафрагм разного размера (см. рис. 2 в ст. «Микроскопия»), Цифры, появляющиеся в окне барабана при его повороте, показывают, каким объективом (х10, х20, х40 или х90) следует пользоваться при диафрагме, величина которой видна в окне в данный момент; цифра О означает отсутствие диафрагмы (работа конденсора в обычном режиме). В этом положении устанавливают стандартное освещение. Затем фокусируют на препарате намеченный к работе объектив.

Изображение, как правило, видно очень плохо, но нужно добиться его фокусировки. Поворотом барабана устанавливают нужную кольцевую диафрагму. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп, имеющийся в комплекте фазово-контрастного устройства. Он облегчает рассмотрение зоны, где формируется изображение.

Перемещая окуляр этого микроскопа, добиваются резкой видимости двух колечек различной плотности, расположенных в глубине тубуса микроскопа. Одно из них образовано кольцевой щелью в диафрагме конденсора; другое представляет собой так называемую фазовую пластинку - полупрозрачное колечко из специального покрытия, нанесенное на одну из линз объектива. Изображения этих колечек, как правило, не совпадают друг с другом. Движением центрирующих винтов, расположенных под барабаном, перемещают диафрагму так, чтобы ее изображение полностью совпало с фазовой пластинкой. После этого заменяют вспомогательный микроскоп обычным окуляром и начинают наблюдение фазово-контрастированного изображения.

Примерно такими же приемами можно получить амплитудное контрастирование в микроскопах амплитудно-контрастного (аноптрального) типа.

После смены препарата следует проверить, сохранились ли условия освещения, так как толщина предметных стекол колеблется и плоскость объекта может не совпасть с ранее установленной плоскостью фокуса конденсора. Для проверки нужно закрыть диафрагму осветителя. Если ее изображение при объективе, сфокусированном на новом препарате, окажется нерезким, нужно изменить высоту конденсора, после чего снова открыть диафрагму до размера поля зрения.

Микроскопирование лучше вести при помощи бинокулярной насадки; она распределяет световую нагрузку на оба глаза, которые в результате меньше утомляются при длительной работе.

Несмотря на значительные успехи микрофотографии и микрокиносъемки за последние годы, рисовальные аппараты остаются весьма полезными при работе с толстыми, многоплановыми объектами, которые невозможно сфотографировать из-за большой глубины. Промышленность выпускает рисовальный аппарат РА-4, пользование которым не вызывает затруднений. Аппаратура для микрофотосъемки (микро-фотонасадка МФН и др.) проста, доступна и удобна в обращении. Однако получение высококачественных микрофотографий требует большой практики.

Окончив работу с микроскопом, нужно прикрыть его от пыли. Если использовали иммерсионный объектив, кедровое масло нужно осторожно стереть чистой ладонью и отмыть его следы с фронтальной линзы объектива чистой тряпочкой, слегка увлажненной бензином или ксилолом (обильно смачивать нельзя, так как эти вещества могут растворить клей, скрепляющий линзы объектива).

Правила ухода за микроскопом описаны в инструкции к нему.

Бактериоскопия - это исследование бактерий при помощи светового микроскопа - широко применяется в медицинской практике. Бактериоскопическому исследованию (см. Бактериологическое исследование) подвергают фиксированные окрашенные препараты, а также бактерии в живом состоянии в препаратах «висячая» или «раздавленная» капли (см. Висячая капля, Раздавленная капля).

Изготовление микроскопических препаратов - см. Бактериологическая техника. Бактериологическое исследование, Вирусологические исследования, Гистологическая техника. К любому микроскопическому препарату предъявляется одно общее требование: толщина предметного стекла не должна превышать 1,2-1,4 мм, покровного - 0,4 мм.

Для исследования дрожжей, бактерий и плесневых грибов применяют микроскопы, предназначенные для рассмотрения прозрачных препаратов в проходящем свете (рис. 8).

Оптическая часть микроскопа . Основной частью оптической системы микроскопа является объектив, увеличивающий изображение предмета. Он состоит из ряда линз, склеенных канадским бальзамом и заключенных в металлическую трубку; на трубке имеется резьба, при помощи которой объектив ввинчивается в специальное гнездо револьвера.

Изображение, даваемое объективом, рассматривают с помощью окуляра, находящегося в верхней части тубуса микроскопа. Биологические микроскопы снабжаются тремя сменными окулярами. На верхней оправе линзы окуляра указано его увеличение. Обычно окуляры дают увеличение в 7, 10 и 15 раз. Общее увеличение объекта микроскопом равно произведению увеличения окуляра на увеличение объектива = 900 раз.

Осветительное устройство располагается под столиком микроскопа и состоит из конденсора с ирис-диафрагмой и зеркала.

Механическая часть микроскопа . Эта часть состоит из штатива, тубусодержателя с револьвером, винтов для передвижения тубуса (макрометрического и микрометрического), осветительного аппарата и предметного столика микроскопа. Основными частями штатива являются нижняя подставка (ножка), придающая микроскопу устойчивость, и тубусодержатель микроскопа.

Техника микроскопирования . Прежде чем начать микроскопирование, необходимо установить правильное освещение. Для этого с микроскопа снимают окуляр и, глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало так, чтобы источник света (лампа или окно) были видны посредине объектива. После предварительной установки света на предметный столик микроскопа кладут готовый препарат и закрепляют его зажимами. При помощи макрометрического винта опускают тубус почти до соприкосновения с покровным стеклом. Затем, глядя в окуляр, постепенно поднимают тубус до появления изображения. Для наведения резкости пользуются микрометрическим винтом.

При микроскопиравании следует держать оба глаза открытыми. Смотрят в микроскоп левым глазом.

Техника приготовления препарата для микроскопирования . Каплю исследуемой жидкости наносят на чистое предметное стекло и осторожно накрывают покровным стеклом. Если препарат готовят с плотной питательной среды, то на предметное стекло наносят капельку чистой водопроводной воды, в нее помещают исследуемую культуру и препарат накрывают покровным стеклом. Под последним не должно оставаться пузырьков воздуха, так как они мешают микроскопированию. Избыток жидкости, выступающий из-за покровного стекла, убирают фильтровальной бумагой, заранее нарезанной небольшими узкими полосками. Готовый препарат помещают на предметный столик и исследуют.

Светопольная микроскопия.

Устройство биологического микроскопа

и техника микроскопирования.

Устройство светового биологического микроскопа .

Все световые биологические микроскопы отечественного производства условно можно разделить на три группы: микроскопы биологические упрощенные, микроскопы биологические рабочие, микроскопы биологические исследовательские. Они предназначены для исследования препаратов в проходящем свете в светлом поле.

Принципиальное устройство биологических микроскопов практически одинаково.

В настоящем руководстве производится описание устройства и правил работы с биологическим микроскопом типа «Биомед».

Микроскоп (от греческого слова micros – малый, scopeo – смотрю) – это оптический прибор (рис.1) состоящий из трёх основных частей: механичес-кой, оптической и осветительной.

Механическая часть и осветитель . Нижняя часть штатива массивная и служит опорой микроскопа. Источником освещения света служит электрическая лампочка, вмонтированная в основание микроскопа. На боковой панели основания расположены выключатель осветителя (2) и регулятор освещения препарата (17). На штативе укреплен крестообразный столик, благодаря которому с помощью винтов препаратоводителя препараты могут перемещаться в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Тубусодержатель (11) связан с основанием микроскопа неподвижно. Фокусировка препарата осуществляется с помощью макромет ри ческого (14) и микрометрического (15) винтов.

Макрометрический винт служит для грубой настройки микроскопа. Для точной фокусировки пользуются микровинтом .

Правило работы с микровинтом . Полных оборотов микровинтом делать нельзя. Вначале необходима грубая настройка. Разрешается поворачивать микровинт в ту или иную сторону не более 2…4х делений (не более пол-оборота).

Отличительной особенностью микроскопа БИОМЕД - 4 , которым оснащены наши микробиологические лаборатории, является его оснащенность бинокулярной насадкой, отсутствием адаптера видео/фотонасадки (10), а также переключателя светового потока (12).

В верхнюю часть тубусодержателя вставляется вместо тринокулярной бинокулярная насадка (11) с окулярами. На тубусодержателе укреплен револьвер с объективами(8).

Рис.1 Общий вид микроскопа БИОМЕД-1:

1 – подложка основания; 2 - основание микроскопа с выключателем; 3 –осветитель; 4 – конденсор Аббе; 5 – предметный столик с измерительным нониусом; 6 – держатель препарата; 7 – объективы; 8 – револьверная головка; 9 – окуляры; 10 – адаптер видео/фотонасадки; 11 – тринокулярная насадка; 12 – переключатель светового потока; 13 – штатив; 14 –макрометрический винт; 15 – микрометический винт; 16 – коаксиальная ручка перемещения препарата; 17 – регулятор яркости осветителя.

Оптическая часть микроскопа состоит из конденсора системы Аббе с ирисовой диафрагмой, объективов и окуляров. Рукояткой (4) можно регулировать объем лучей света, падающих на препарат, за счет изменения открытого отверстия диафрагмы. Окрашенные препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы. Конденсор (от лат. condenso - уплотняю, сгущаю) собирает лучи, идущие от источника через диафрагму, и направляет их наобъект. С помощью винта конденсора (4), опуская его или поднимая, регулируют степень освещения препарата.

Правило работы с конденсором. При работе с большими увеличениями микроскопа конденсор должен находиться в верхнем положении. При работе с малыми увеличениями микроскопа конденсор опускают вниз.

Объектив (греч. objectum – предмет исследования)представляет собой наиболее важную часть микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, носит название фронтальной, она обеспечивает увеличение. Увеличение объектива всегда обозначено на его оправе. Микроскоп БИОМЕД – 4 оснащен объективами, увеличивающими в 4, 10, и 40 (сухие) и 100 (иммерсионный) раз.

От кривизны фронтальной линзы объектива зависит его фокусное расстояние и увеличение. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем больше увеличение объектива. Это необходимо помнить при микроскопировании – чем большее увеличение дает объектив, тем меньше свободное рабочее расстояние и тем ниже следует опускать его над плоскостью препарата (табл.1).

Таблица 1. Оптические данные объективов микроскопа «Биомед-4»

Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследова-нии объектов. Как известно, изображение, получаемое при помощи линз, обладает рядом недостатков – аберраций . Наиболее существенные – сферическая и хроматическая аберрации . Первая проявляется в невозможности одновременной фокусировки всего поля зрения, вторая связана с разложением белого света на спектр, в результате чего изображение преобретает радужную окраску. Объективы, у которых сферическая и хроматическая аберрации скоррегированы не полностью, называются ахроматами . Они содержат до шести линз и дают изображение наиболее резкое в центре. Края поля зрения при использовании ахроматов бывают окрашены в разные цвета спектра. Ахроматы широко распространены вследствие своей простоты и дешевизны.

Более совершенные объективы – апохроматы . Хроматическая погрешность в них почти в 10 раз меньше, чем у ахроматов. Апохроматы обеспечивают более равномерную резкость изображения. На их оправе имеется обозначение «Апохр». Полностью устраняют искривление поля зрения планахроматы . Эти объективы применяют главным образом при микрофотографировании.

Кроме того, объективы делятся на сухие и иммерсионные. Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и рассматриваемым предметом находится воздух. Вследствие того, что лучи света проходят среды с различными показателями преломления (покровное стекло и воздух), часть их отклоняется и не попадает в объектив. Иммерсионными (от лат. immersion – погружаю) называются объективы, фронтальная линза которых при работе погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла.

Окуляр (от лат. oculus – глаз) состоит из двух линз –- глазной (верхней) и собирательной (нижней). Окуляр служит для рассмотрения изображения предмета, даваемого объективом. Увеличение объективов указано на их оправе. В комплект к микроскопам типа БИОМЕД-4входит объектив с увеличением 10х.

Микроскоп БИОМЕД-4снабжен бинокулярной насадкой, которая имеет собственное увеличение (около 1,5х) и снабжена коррекционными линзами. Бинокулярной насадкой следует пользоваться при длительной работе с микроскопом. Корпус насадки может раздвигаться в пределах 55…75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Работа с бинокулярной насадкой улучшает видимость объекта, снижает яркость изображения и тем самым сохраняет зрение.

1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.

2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.

3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.

4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.

5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения (8х) на объективы большего увеличения (40х,90х).

а) При работе со средним увеличением (объектив 40х) диафрагму конденсора слегка приоткрывают, чтобы усилить освещение. Фокусируют при помощи микрометрического винта.

б) При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхность стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанавливают микрометрическим винтом.

Изучаемые объекты, как правило, принято зарисовывать. Для этого препарат помещается в поле зрения микроскопа в положении наиболее удобном для зарисовки, что достигается передвижением предметного столика. Зарисовка производится по возможности точно в отношении размера, формы, расположения клеток бактерий, дрожжей, органов спороношения мицелиальных грибов и т.д.

Правила обращения с микроскопом

1. Микроскоп следует оберегать от пыли, т.е. хранить в футляре или под колпаком.

2. Нельзя оставлять микроскоп на солнце или около зажженой горелки, т.к. может расплавиться канадский бальзам, которым склеены линзы в объективах.

3. Окончив просмотр препарата, сначала поднимают тубус, а затем снимают со столика препарат.

4. По окончании работы с микроскопом, подняв тубус и поставив объектив в удобное положение, осторожно, протирают его фронтальную линзу при помощи чистой мягкой хлопчатобумажной ткани или специальной фланели.

5. Особое внимание обращают на иммерсионный объектив, масло с поверхности которого удаляют указанной тканью, смоченной очищенным бензином или спиртом.

Нельзя допускать присыхания масла на объективе .

6. Особенно бережно необходимо относиться:

а) к микрометрическому винту - не делать полных оборотов.

б) к иммерсионному объективу, т. к. из-за короткого фокусного расстояния его фронтальной линзы, легко можно раздавить предметное стекло с препаратом, что может привести к появлению царапин на линзе.

Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, различающихся по форме, размерам, взаимному расположению клеток, наличию или отсутствию спор, жгутиков, капсул и т. д. (Рис. 3,4).

Для определения группы или вида бактерий, прежде всего, изучают их морфологические признаки: формы и сочетания клеток, их размеры, подвижность, способность к спорообразованию, отношение к окраске по Граму, наличие капсул и клеточных включений. Изучение морфологических признаков бактерий осуществляется обычно с помощью оптического микроскопа.

Рис. 3. Основные формы бактерий:

1-стафилококки; 2-3-диплококки; 4-стептококки; 5-тетракокки; 6-сарацины; 7-9-различные виды палочек.

Рис. 4. капсулы, споры и жгутики бактерий:

а-капсулы; б-форма и расположение спор; в-монотрихи; г-лофотрихи;

д-перитрихи.

Для изучения бактерий под микроскопом готовят препараты на предметном стекле. Предметные стекла – это пластинки из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями. Сверху препарат закрывается покровным стеклом. Их размеры – 18x18, 20x20 мм и др. Все стекла (предметные и покровные) должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Стекла считаются чистыми в том случае, если вода легко расплывается на поверхности стекла, не образуя капель шаровидной формы.

Очистка новых стекол производится в течение 10 минут в 1% растворе соды с последующей промывкой дистиллированной водой, затем слабой соляной кислотой и вновь дистиллированной водой. Стекла бывшие в употреблении, выдерживаются и концентрированной серной кислоте, промываются водой, кипятятся в 2% растворе соды в течение 10 минут, после чего тщательно промываются дистиллированной водой.

Обезжиренные стекла хранят в закрытой чистой коробке и при употреблении следует их брать так, чтобы не прикасаться к их поверхности.

Микроскопирование бактерий можно проводить, рассматривая их как в живом состоянии, так и в мертвом, в специально приготовленных окрашенных препаратах. Последние весьма широко используются в практике, т.к. вследствие слишком малых размеров клеток бактерий, в живом состоянии не удается рассмотреть некоторые детали их строения, (оболочка, включения, наличие спор), в то время как они более четко выявляются при окрашивании мертвых клеток специальными красками.